Specific highly fluorescent FRET substrate for the determination of caspase-1 (ICE) and caspase-1-like enzyme activities. Cleavage of Mca-YVADAPK(Dnp) at the P1 Asp residue results in a continuous fluorescent assay monitored at an emission wavelength of 392 nm. Caspase-3 (apopain, CPP-32) is only weakly active on this substrate. Both caspase-1 and caspase-3 are involved in apoptosis. A specific substrate for renal ACE 2.

Definition
Apoptosis or programmed cell death is a normal component of the development and health of multicellular organisms. Cells die in response to a variety of stimuli and during apoptosis they do so in a controlled, regulated fashion.

Discovery
In 1885,  Flemming W described the process of programmed cell death. John Kerr's discovery, in late 1960s, initially called "shrinkage necrosis" but which he later renamed "apoptosis", came about when his attention was caught by a curious form of liver cell death during his studies of acute liver injury in rats 1,2.  Kerr in 1972 proposed the term apoptosis is for mechanism of controlled cell deletion, which appears to play a complementary but opposite role to mitosis in the regulation of animal cell populations. Its morphological features suggest that it is an active, inherently programmed phenomenon, and it has been shown that it can be initiated or inhibited by a variety of environmental stimuli, both physiological and pathological 3. 

Structural Characteristics
Heterodimerization between members of the Bcl-2 family of proteins is a key event in the regulation of programmed cell death. The molecular basis for heterodimer formation was investigated by determination of the solution structure of a complex between the survival protein Bcl-xL and the death-promoting region of the Bcl-2-related protein Bak. The structure and binding affinities of mutant Bak peptides indicate that the Bak peptide adopts an amphipathic  helix that interacts with Bcl-xL through hydrophobic and electrostatic interactions. Mutations in full-length Bak that disrupt either type of interaction inhibit the ability of Bak to heterodimerize with Bcl-xL 4.

The structure of the 16–amino acid peptide complexed with a biologically active deletion mutant of Bcl-xL was determined by nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR). The structure was determined from a total of 2813 NMR-derived restraints and is well defined by the NMR data. The Bak peptide forms a helix when complexed to Bcl-xL. The COOH terminal portion of the Bak peptide interacts predominantly with residues in the BH2 and BH3 regions. Melanoma inhibitor of apoptosis (ML-IAP) is a potent anti-apoptotic protein that is upregulated in a number of melanoma cell lines but not expressed in most normal adult tissues. Overexpression of IAP proteins, such as ML-IAP or the ubiquitously expressed X-chromosome-linked IAP (XIAP), in human cancers has been shown to suppress apoptosis induced by a variety of stimuli. X-ray crystal structures of ML-IAP-BIR in complex with Smac- and phage-derived peptides, together with peptide structure−activity-relationship data, indicate that the peptides can be modified to provide increased binding affinity and selectivity for ML-IAP-BIR relative to XIAP-BIR3 5.

Mode of Action
Upon receiving specific signals instructing the cells to undergo apoptosis a number of distinctive changes occur in the cell. Families of proteins known as caspases are typically activated in the early stages of apoptosis. These proteins breakdown or cleave key cellular components that are required for normal cellular function including structural proteins in the cytoskeleton and nuclear proteins such as DNA repair enzymes. The caspases can also activate other degradative enzymes such as DNases, which begin to cleave the DNA in the nucleus.

Apoptotic cells display distinctive morphology during the apoptotic process. Typically, the cell begins to shrink following the cleavage of lamins and actin filaments in the cytoskeleton. The breakdown of chromatin in the nucleus often leads to nuclear condensation and in many cases the nuclei of apoptotic cells take on a "horse-shoe" like appearance. Cells continue to shrink, packaging themselves into a form that allows for their removal by macrophages. There are a number of mechanisms through which apoptosis can be induced in cells. The sensitivity of cells to any of these stimuli can vary depending on a number of factors such as the expression of pro- and anti-apoptotic proteins (eg. the Bcl-2 proteins or the Inhibitor of Apoptosis Proteins), the severity of the stimulus and the stage of the cell cycle. The Bcl-2 family of proteins plays a central role in the regulation of apoptotic cell death induced by a wide variety of stimuli. Some proteins within this family, including Bcl-2 and Bcl-xL, inhibit programmed cell death, and others, such as Bax and Bak, can promote apoptosis 6, 7.

Functions

For development, Apoptosis is as needed for proper development as mitosis is.  Examples: The resorption of the tadpole tail at the time of its metamorphosis into a frog occurs by apoptosis.

Integrity of the organism, Apoptosis is needed to destroy cells that represent a threat to the integrity of the organism. Examples: Cells infected with viruses8.

Cells of the immune system, as cell-mediated immune responses wane, the effector cells must be removed to prevent them from attacking body constituents. CTLs induce apoptosis in each other and even in themselves 9.

Cells with DNA damage, damage to its genome can cause a cell to disrupt proper embryonic development leading to birth defects to become cancerous.

References

1.     Kerr JF (1965). A histochemical study of hypertrophy and ischaemic injury of rat liver with special reference to changes in lysosomes. Journal of Pathology and Bacteriology, 90(90):419-435.

2.     Kerr JF, Wyllie AH, Currie AR (1972). Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. Br. J. Cancer., 26(4):239-257.

3.     O'Rourke MG, Ellem KA (2000). John Kerr and apoptosis. Med. J. Aust., 173(11-12): 616-617.

4.     Franklin MC, Kadkhodayan S, Ackerly H, Alexandru D, Distefano MD, Elliott LO, Flygare JA, Mausisa G, Okawa DC, Ong D, Vucic D, Deshayes K, Fairbrother WJ (2003). Structure and function analysis of peptide antagonists of melanoma inhibitor of apoptosis (ML-IAP). Biochemistry, 42(27):8223-8231.

5.     Sattler M, Liang H, Nettesheim D, Meadows RP, Harlan JE, Eberstadt M, Yoon HS, Shuker SB, Chang BS, Minn AJ, Thompson CB, Fesik SW (1997). Structure of bcl-xl-bak peptide complex: recognition between regulators of apoptosis. Science, 275(5302):983-986.

6.     Hanada M, Aimé-Sempé C, Sato T, Reed JC (1995). Structure-function analysis of Bcl-2 protein. Identification of conserved domains important for homodimerization with Bcl-2 and heterodimerization with Bax. J. Biol. Chem., 270(20):11962-11969.

7.     Cheng EHY, Levine B, Boise LH, Thompson CB, Hardwic JM (1996). Bax-independent inhibition of apoptosis by Bcl-xL.Nature, 379:554-556.

8.     Alimonti JB, Ball TB, Fowke KR (2003). Mechanisms of CD4+ T lymphocyte cell death in human immunodeficiency virus infection and AIDS. J Gen Virology., 84(84): 1649-1661.

9.     Werlen G, Hausmann B, Naeher D, Palmer E (2003). Signaling life and death in the thymus: timing is everything. Science. 299(5614):1859-1863.

荧光标记所依赖的化合物称为荧光物质。荧光物质是指具有共轭双键体系化学结构的化合物，受到紫外光或蓝紫光照射时，可激发成为激发态，当从激发态恢复基态时，发出荧光。荧光标记技术指利用荧光物质共价结合或物理吸附在所要研究分子的某个基团上，利用它的荧光特性来提供被研究对象的信息。荧光标记的无放射物污染，操作简便等优点，使得荧光标记物在许多研究领域的应用日趋广泛。人们利用利用荧光标记的多肽来检测目标蛋白的活性，并将其发展的高通量活性筛选方法应用于疾病治疗靶点蛋白的药物筛选和药物开发（例如，各种激酶、磷酸酶、肽酶等）。专肽生物经过长期开发，能够提供技术成熟的各种荧光标记多肽。

• 荧光共振能量转移（Fluorescence resonance energy transfer, FRET)

  

        荧光共振能量转移（FRET)是一种非辐射能量跃迁，通过分子间的电偶极相互作用，将供体激发态能量转移到受体激发态的过程。此过程没有光子的参与，所以是非辐射的。该分析方法具有快速、敏感和简单等优点。
        用于FRET试验的染料是可以相同的。但在大多数应用中其实是使用不同的染料。例如，一个供体基团（EDANS）和接受基因（DABCYL）匀被连接到一HIV蛋白酶的天然底物上，当该底物未被切断时，DABCYL可淬灭EDANS，从而检测不到荧光。当该底物被HIV-1蛋白酶切断后，EDANS不再被DABCYL淬灭，随即可检测到EDANS荧光。蛋白酶抑制剂的有效性可凭借EDANS荧光强度的变化进行监测。
        FRET肽是研究肽酶特异性的便利工具，由于其反应过程可被连续监测，为酶活性的检测提供了一个便捷的方法。供体/受体对的肽键水解后产生的荧光可衡量纳摩尔级浓度的酶活性。当FRET肽是完整的，表现出的是内部的荧光猝灭，但当供体/受体对的任何肽键断裂就会释放出荧光，此荧光可被连续检测，从而可对酶的活性进行定量分析。FRET 肽可作为各类酶研究的合适底物，比如：肽酶、蛋白酶、激酶、磷酸酶的动力特征和功能特征；对新的蛋白水解酶的筛选和检测；对多肽折叠的构象研究等。

1、常用FRET的标准染料组合。

常用FRET的标准染料组合

FAM/Lys(Dabcyl)

FAM/TAMRA

MCA/Lys(Dnp)

Abz/Tyr (NO2)

Abz/Dnp

Abz/EDDnp

Dabcyl/Glu(EDANS)

Dansyl//Glu(EDANS)

2、FRET共振能量转移引发荧光猝灭的激发与发射波

猝灭剂	荧光团	激发波(nm)	发射波(nm)
Dabcyl	Edans	336	490
Dansyl	Trp	336	350
DNP	Trp	328	350
DNP	MCA	328	393
DNP	Abz	328	420
Tyr (NO2)	Abz	320	420

3、常规RET供体(Donor)-接受(Aceptor)对的福斯特临界距离(Forster Critical Distance)

供体	受体	福斯特临界距离(nm)
Cy5	Cy5.5	>8.0
B-Phycoerythrin	Cy5.5	7.2
FITC	Eosin Thiosemicarbazide	6.1-6.4
Rhodamine 6G	Malachite Green	6.1-6.4
BODIPY FL (1)	BODIPY FL (1)	5.7
GFP	YFP	5.5-5.7
Cy3	Cy5.5	5
Fluorescein	Tetramethylrhodamine	4.9-5.5
CF (2)	Texas Red	5.1
CFP	GFP	4.7-4.9
Dansyl	Octadecylrhodamine	4.3
Dansyl	FITC	3.3-4.1
BFP	DsRFP	3.1-3.3
IAEDANS (4)	DDPM (3)	2.5-2.9
Tryptophan	Dansyl	2.1
(1): 4,4-difluoro-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene
(2): carboxyfluorescein succinimidyl ester
(3): N-(4-dimethylamino-3,5-dinitrophenyl) maleimide
(4): 5-(2-iodoacetylaminoethyl)aminonaphthalene-1-sulfonic acid

FRET荧光共振能量转移

对于分子生物学来讲，生物分析手段的发展，是阐明机理的必要条件。在研究分子间相互作用的道路上，人们不断探索，总结出很多方法，免疫技术，晶体衍射，核磁共振等。1948年，荧光共振能量转移（Fluorescence resonance energy transfer，FRET）理论被首次提出，它可以测定1.0-6.0nm距离内分子间的相互作用。1967年，这一理论得到了实验验证，将1.0-6.0nm的距离称为光学尺。二十世纪八十年代出，通过科学家的不断探索，Fret技术成功运用到蛋白质结构的研究中。自Fret荧光共振能量技术诞生以来，已结合多种先进的技术和方法，如电子显微镜，X射线衍射等，推动了分子生物学检测手段的发展。

1、作用原理

荧光共振能量转移技术，是采用物理方法去检测分子间的相互作用的方法。他适用于在细胞正常的生理条件下，验证已知分子间是否存在相互作用。此方法的检测原理如下；

将我们要检测的蛋白（如图X和Y），分别偶联上D和A荧光蛋白，D和A是一对荧光物质，我们称之为供体（donor）和受体（acceptor）。当用430nm的紫光去激发X融合蛋白时，它能够产生490nm的蓝色荧光；同样，当我们用490nm的蓝光去激发Y融合蛋白时，它能够产生530nm的黄色荧光。（结合图1） 。

当蛋白X和Y间没有相互作用时（两者的空间距离>10nm），融合蛋白X和Y分别产生相应的荧光而被检测到，

如果蛋白X和Y间存在相互作用（两者的空间距离需<10nm，结合图2），用紫光激发融合蛋白X其产生的蓝光会被融合蛋白Y吸收，从而产生黄色荧光，这时，在细胞内将检测不到蓝色荧光的存在。这时因为能量从X融合蛋白转移到了Y融合蛋白，这就是荧光共振能量转移技术。

2、技术难点

一个理想的Fret相互作用体系，要求要有一对合适的荧光物质， 即供体的发射光谱与受体的吸收光谱有明显的重叠。且当供体的激发波长时对受体无影响，供体和受体的发射光谱要完全分开，否则容易造成光谱干涉，而使反应体系不稳定。目前，较为常用的供体-受体分子对，主要有绿色荧光蛋白类（GFPs）和染料类。绿色荧光蛋白类有CFP-YFP，BFP-GFP，BFP-YFP等，染料类的有Cy3-Cy5，FITC-Rhodamine等。且这些荧光物质要能够标记在研究对象上。

3、应用要求

• 供体荧光基团和受体荧光基团的空间距离要<10nm；
• 供体的发射光谱与受体的接收光谱有相当的重叠；
• 供体、受体分子在量子产率、消光系数、水溶性、抗干扰能力等方面要求较高。

4、优缺点

优点	缺点
在活细胞的正常生理条件下进行检测，观察大分子在细胞内的构象变化与相互作用，并弥补了需破碎细胞检测相互作用的缺点	应用比较局限，一般需要在待检测分子上偶联荧光物质（加上标记）
灵敏度高，可实现对单细胞水平的研究，研究单个受体分子	对实验要求较高，如供受体的光谱重叠不好，会导致荧光干扰，对供受体的抗干扰能力，水溶性等要求高
可与多种仪器和技术结合使用，如显微镜，色谱技术，电泳，流失细胞技术等	需要不断探索合适的供体和受体，且能够标记分子 难以观察瞬时的分子间作用，检测要求大量的样品

5、应用

• 细胞内分子间的相互作用
• 膜蛋白的研究
• 细胞膜受体蛋白间的相互作用
• 细胞凋亡的研究
• 核酸检测

6、实验流程简述

以荧光物质CFP（供体）-YFP（受体）为例，检测AB蛋白在细胞内的相互作用。

1. 细胞培养：根据实验培养特定的细胞用于转染，观察检测分子在细胞内的相互作用；
2. 细胞转染：构建质粒载体CFP-A和YFP-B，将检测的AB蛋白分别偶联上荧光蛋白CFP和YFP，并将两个质粒共转染到培养的细胞内；
3. 检测 FRET：质粒载体CFP-A和YFP-B转染细胞 10h、12h、18h、24h、36h、48h、72h 后检测，是否发生Fret；
4. FRET图像采集： 确定 FRET 配对的激发波长， 蓝光被调谐分别用于探测最大和最小的供体和受体信号， 最大供体信号和最小受体信号对应的波长用于收集双表达细胞的 FRET信号。调整激光变化，以便获取最大 CFP 信号和最小 YFP 信号的激发光波长， 采集供体和受体图像，收集 FRET 信号。每个细胞 FRET 检测重复 3 次，每种转染至少完成 6 个细胞的 FRET 检测;
5. FRET 数据处理： 去除 FRET 信号中 DSBT 和 ASBT 的光谱串色信号； 受体通路的FRET 信号需要对供体受体光谱灵敏度的变化进行矫正、对自发荧光和光学噪声进行矫正； 利用矫正系数对双标定细胞进行象素匹配矫正。

7、案例

最常见的一对标记组合是 Dancyl和Edans，

在本例中，荧光团 (EDANS) 和猝灭剂 (DABCYL) 与 HIV 蛋白酶的天然底物相连。在未裂解的底物中，DABCYL 淬灭 EDANS，因此没有可检测到的荧光。底物被 HIV-1 蛋白酶切割后，DABCYL 不再淬灭 EDANS，从而检测到 EDANS 荧光。然后可以监测 EDANS 荧光强度的变化以评估蛋白酶抑制剂的效率。

FRET 肽可用于研究肽酶特异性，因为它们可以连续监测反应，从而快速确定酶活性。供体/受体对之间的肽键可以被切割，从而产生荧光信号以测量纳摩尔浓度的酶活性。当未被切割时，FRET 肽会淬灭内部荧光；然而，供体/受体对之间肽键的断裂会释放出可以连续检测到的荧光信号，从而可以量化酶的活性。

FRET 肽在许多不同的酶研究中用作合适的底物：

肽酶、蛋白酶、激酶和磷酸酶的动力学和功能表征。
筛选和检测新型蛋白水解酶。
肽折叠的构象研究。

Definition

Caspases are a family of aspartate specific cysteine proteases that play an important role in apoptosis, necrosis and inflammation1.

Discovery

Caspases were first identified in the nematode C. elegans. It was found that the gene ced-3 was required for cell death during C.elegans development2. In 1993, the protein encoded by the ced-3 gene was identified as a cysteine protease and it was found that it had similar properties to the mammalian interleukin-1-beta converting enzyme (ICE) (now known as caspase 1) which at the time was the only known caspase3. Other mammalian caspases were subsequently identified.                                                                          

Classification

There are three types of apoptotic caspases: initiator, effector and inflammatory caspases. Initiator caspases (e.g. CASP2, CASP8, CASP9 and CASP10) cleave inactive pro-forms of effector caspases, thereby activating them4. Effector caspases (e.g. CASP3, CASP6 and CASP7) in turn cleave other protein substrates within the cell, to trigger the apoptotic process4. Inflammatory caspases are involved in immune response (e.g. CASP1, CASP4, CASP5, CASP11, CASP12 and CASP13). Caspase inhibitors regulate the initiation of this cascade4.

Structural Characteristics

Caspases are synthesized as inactive zymogens or procaspases.  Activation of caspases occurs by cleavage of the prodomain in the procaspases5.  The caspase catalytic domain is composed of a twisted, mostly parallel ß-sheet sandwiched between two layers of a-helices. Also they contain an active cysteine residue in their catalytic domain5.  In addition to the catalytic domain, both inflammatory and initiator caspases carry at their N-termini, one or two copies of CARD or DED modules, which are critical for their activation in vivo. These modules are mainly composed of six antiparallel a-helices, with helices a1–a5 building an a-helical Greek key5. The general structure of a caspase inhibitor is [tetrapeptide]-CO-CH2-X, that binds to the Cys285 in the active site of caspases5.

Mode of action

Caspases cleave the substrate after an Asp residue6.  There are several hundred substrates for caspases.  Initially activation of initiator caspases occurs as a result of an extrinsic or intrinsic death signal6.  Activated initiator caspases cleave effector caspases that in turn cleave the substrate at an Asp residue6.  For example, caspase-8 cleaves the pro-apoptotic protein Bid that gets activated and translocates into the mitochondria where it activates other pro-apoptotic proteins, Bax and Bak thus amplifying the death signal6.

Functions

Caspases such as caspase-1 are involved in the activation of pro-inflammatory cytokines such as Interleukin 1 and interleukin 185,6.  Caspases play an important role in apoptosis. One of the hallmark feature of apoptotic cell death is genomic disassembly and proteolysis5,6.   By cleaving their substartes, caspases inactivate cell cycle progression and DNA repair processes.  They also activate several pro-apoptotic proteins5,6.  In some cases Caspases’ role in aberrant processing events has shown their involvement in neurodegenerative disorders such as Huntington disease and Alzheimer’s disease6.  Some of the final targets of caspases include: nuclear lamins, ICAD/DFF45 (inhibitor of caspase activated DNase or DNA fragmentation factor 45), PARP (poly-ADP ribose polymerase) and PAK2 (P 21-activated kinase 2)6.  Caspases are also implicated in embryonic development and T and B cell differentiation7.

References

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2.     Ellis HM, Horvitz HR (1986). Genetic control of programmed cell death in the nematode C. elegans. Cell, 44(6), 817-29.

3.     Yuan J, Shaham S, Ledoux S, Ellis HM and Horvitz HR (1993). The C. elegans cell death gene ced-3 encodes a protein similar to mammalian interleukin-1 beta-converting enzyme. Cell 75: 641–652.

4.        Salvesen GS, Riedl SJ (2008). Caspase mechanisms. Adv Exp Med Biol., 615, 13-23.

5.     Prior PF and Salvesen GS (2004). The protein structures that shape caspase activity, specificity,activation and inhibition. Biochem. J., 384, 201–232.

6.     Nicholson DW (1999). Caspase structure, proteolytic substrates, and function during apoptotic cell death. Cell Death and Differentiation, 6, 1028 ± 1042.

7.     Maelfait J, Beyaert R (2008). Non-apoptotic functions of caspase-8. Biochem Pharmacol., 76(11), 1365-73.

Caspase酶对应的底物，Caspases（半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶，半胱氨酸依赖性天冬氨酸定向蛋白酶）是一类蛋白酶家族，其功能与凋亡（程序性细胞死亡），坏死和发烧（炎症）的过程密切相关。

       什么是胱天蛋白酶？

      胱天蛋白酶（Caspases）是含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶，它们是为细胞凋亡的主要介质。多种受体，例如TNF-α 受体，FasL受体，TLR和死亡受体，以及Bcl-2和凋亡抑制剂（IAP）蛋白家族参与并调节该caspase依赖性凋亡途径。一旦Caspase受到上游信号（外部或内在）刺激被激活，即会参与执行下游蛋白底物的水解作用，并触发一系列事件，导致细胞分解，死亡，吞噬作用和细胞碎片的清除。

      人Caspases酶

      人的Caspases家族基于序列相似性和生物学功能等共性主要可分为三大类：第一类由具有长胱天蛋白酶募集结构域的“炎症”胱天蛋白酶组成，他们对P4位上的较大的芳香族或疏水性残基具有亲和力。第二类由具有短的前体结构域的“细胞凋亡效应”胱天蛋白酶组成，而第三类由具有长的前提结构域的Pap位置具有亮氨酸或缬氨酸底物亲和力的“凋亡引发剂”胱天蛋白酶组成（表1）。

       表1. 人胱天蛋白酶的功能分类：

细胞死亡途径	半胱天冬酶类型	酵素	物种
细胞凋亡	启动器	Caspases 2	人与鼠
细胞凋亡	启动器	Caspases 8	人与鼠
细胞凋亡	启动器	Caspases 9	人与鼠
细胞凋亡	启动器	Caspases 10	人的
细胞凋亡	效应器	Caspases 3	人与鼠
细胞凋亡	效应器	Caspases 6	人与鼠
细胞凋亡	效应器	Caspases 6	人与鼠
细胞焦亡	炎性的	Caspases 1	人与鼠
细胞焦亡	炎性的	Caspases 4	人的
细胞焦亡	炎性的	Caspases 5	人的

       启动器Caspase和效应器Caspase酶

      根据其在凋亡胱天蛋白酶途径中的作用，胱天蛋白酶可分为两类：启动器和效应器Caspase酶。启动器和效应器Caspas酶都具有由小亚基和大亚基组成的催化位点，Caspase酶的识别位

      凋亡启动器Caspase酶，例如caspase-2，-8，-9和-10可以启动caspase激活级联反应。Caspase-8对于形成死亡诱导信号复合物（DISC）是必不可少的，并且在激活后，Caspase-8激活下游效应子Caspase（例如Caspase 3）并介导线粒体中细胞色素c的释放。Caspase-8已被证明对IETD肽序列具有相对较高的底物选择性。凋亡效应胱天蛋白酶例如Caspase-3，-6和-7虽然不负责启动级联途径，但是当被激活时，它们在级联的中间和后续步骤中起着不可或缺的作用。Caspase-3（CPP32 / apopain）是关键效应器，因为它放大了来自启动器Caspase的信号，使用对Caspase-3有选择性的DEVD肽序列对活化的Caspase-3进行检测，可以检测Caspase-3的活性。

       Caspase酶底物和抑制剂

      Caspase底物和抑制剂由两个关键成分组成：Caspase识别序列和信号产生或蛋白酶抑制基序。不同Caspase识别序列不同，一般由三个或四个氨基酸组成（表2）。Caspase酶识别序列的N端通常有乙酰基（Ac）或碳苯甲氧基（Z）基团修饰，以增强膜的通透性。对应的Caspase识别特定的肽序列为其酶促反应切割位点，释放产生信号或抑制信号的基序。Caspase的显色和荧光底物均以相似的方式起作用，其中底物的信号或颜色强度与蛋白水解活性成正比。

       表2. Caspase的底物及其序列

多肽	氨基酸序列	对应的Caspase的种类
IETD	Ile-Glu-Thr-Asp	Caspase 8，颗粒酶B
DEVD	Asp-Glu-Val-Asp	Caspase 3、6、7、8或10
LEHD	Leu-Glu-His-Asp	Caspase 9
VAD	Val-Ala-Asp	Caspase 1、2、3、6、8、9或10

         Caspase酶的显色底物

      Caspase的显色底物是有Caspase识别序列及生色基团组成，常见的生色团有pNA（对硝基苯胺或4-硝基苯胺），可使用酶标仪或分光光度计在405 nm处进行光密度检测。

       表3. Caspase的显色底物

底物	Caspase	吸收（nm）	颜色
Ac-DEVD-pNA * CAS 189950-66-1 *	半胱天冬酶3	405 nm	黄色
Z-DEVD-pNA	半胱天冬酶3	405 nm	黄色
Z-IETD-pNA * CAS 219138-21-3 *	半胱天冬酶8，颗粒酶B	405 nm	黄色

       Caspase的荧光底物

      Caspase的荧光底物的结构包含与半胱天冬酶识别相关的荧光团，例如7-氨基-4-甲基香豆素（AMC），7-氨基-4-三氟甲基香豆素（AFC）， Rhodamine 110（R110）或ProRed™620。R110的Caspase底物比基于香豆素的Caspase底物（例如AMC和AFC）更敏感，但由于两步裂解过程，其动态范围更窄。 建议将R110标记的Caspase底物用于终点法测定，而将AMC和AFC标记的 Caspase底物用于动力学测定。

      图.从左到右，分别是AMC（7-氨基-4-甲基香豆素），AFC（7-氨基-4-三氟甲基香豆素），Rhodamine 110（R110）和ProRed™620的激发和发射光谱。

       表4.荧光半胱天冬酶底物。

底物名称	对应的Caspase	Ex（nm）	Em（nm）	ε¹	Φ²
Ac-DEVD-AFC * CAS 201608-14-2 *	半胱天冬酶3、7	376	482	17000	0.53
Ac-DEVD-AMC * CAS 169332-61-0 *	半胱天冬酶3、7	341	441	19000	N / D
Z-DEVD-AFC	半胱天冬酶3、7	376	482	17000	0.53
Z-DEVD-AMC * CAS 1135416-11-3 *	半胱天冬酶3、7	341	441	19000	N / D
Z-DEVD-ProRed™620	半胱天冬酶3、7	532	619	N / D	N / D
（Z-DEVD）2 -R110 * CAS 223538-61-2 *	半胱天冬酶3、7	500	522	80000	N / D
Z-DEVD-ProRed™620	半胱天冬酶3、7	532	619	N / D	N / D
Ac-IETD-AFC * CAS 211990-57-7 *	半胱天冬酶8，颗粒酶B	376	482	17000	0.53
Z-IETD-AFC * CAS 219138-02-0 *	半胱天冬酶8，颗粒酶B	376	482	17000	0.53

       注意：

        1.ε=在其最大吸收波长处的摩尔消光系数（单位= cm ^-1M ^-1）。

      2.Φ=水性缓冲液（pH 7.2）中的荧光量子产率。

       Caspase抑制剂

      Caspase抑制剂能与Caspase的活性位点结合并形成可逆或不可逆的连接，通常，Caspase抑制剂的结构由Caspase识别序列，诸如醛（-CHO）或氟甲基酮（-FMK）的官能团组成。具有醛官能团的胱天蛋白酶抑制剂是可逆的，而具有FMK的抑制剂是不可逆的。半胱天冬酶底物和抑制剂都具有较小的细胞毒性作用，因此，它们是研究半胱天冬酶活性的有用工具。

       表5. 可逆和不可逆的Caspase酶抑制剂

抑制剂	Caspase的种类	是否可逆	Ex（nm）	Em（nm）
Ac-DEVD-CHO * CAS 169332-60-9 *	半胱天冬酶3、7	可逆的	--	--
Ac-IETD-CHO * CAS 191338-86-0 *	半胱天冬酶8	可逆的	--	--
mFluor™450-VAD-FMK	半胱天冬酶1，2，3，6，8，9，10	不可逆的	406	445
mFluor™510-VAD-FMK	半胱天冬酶1，2，3，6，8，9，10	不可逆的	412	505
FITC-C6-DEVD-FMK	半胱天冬酶3、7	不可逆的	491	516
FITC-C6-DEVD-FMK	半胱天冬酶3、7	不可逆的	491	516
FITC-C6-LEHD-FMK	半胱天冬酶9	不可逆的	491	516
FITC-C6-LEHD-FMK	半胱天冬酶9	不可逆的	491	516
FAM-VAD-FMK	半胱天冬酶1，2，3，6，8，9，10	不可逆的	493	517
SRB-VAD-FMK [磺胺丁胺B-VAD-FMK]	半胱天冬酶1，2，3，6，8，9，10	不可逆的	559	577

 Caspase酶对应的底物，Caspases（半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶，半胱氨酸依赖性天冬氨酸定向蛋白酶）是一类蛋白酶家族，其功能与凋亡（程序性细胞死亡），坏死和发烧（炎症）的过程密切相关。

       什么是胱天蛋白酶？

      胱天蛋白酶（Caspases）是含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶，它们是为细胞凋亡的主要介质。多种受体，例如TNF-α 受体，FasL受体，TLR和死亡受体，以及Bcl-2和凋亡抑制剂（IAP）蛋白家族参与并调节该caspase依赖性凋亡途径。一旦Caspase受到上游信号（外部或内在）刺激被激活，即会参与执行下游蛋白底物的水解作用，并触发一系列事件，导致细胞分解，死亡，吞噬作用和细胞碎片的清除。

      人Caspases酶

      人的Caspases家族基于序列相似性和生物学功能等共性主要可分为三大类：第一类由具有长胱天蛋白酶募集结构域的“炎症”胱天蛋白酶组成，他们对P4位上的较大的芳香族或疏水性残基具有亲和力。第二类由具有短的前体结构域的“细胞凋亡效应”胱天蛋白酶组成，而第三类由具有长的前提结构域的Pap位置具有亮氨酸或缬氨酸底物亲和力的“凋亡引发剂”胱天蛋白酶组成（表1）。

       表1. 人胱天蛋白酶的功能分类：

细胞死亡途径	半胱天冬酶类型	酵素	物种
细胞凋亡	启动器	Caspases 2	人与鼠
细胞凋亡	启动器	Caspases 8	人与鼠
细胞凋亡	启动器	Caspases 9	人与鼠
细胞凋亡	启动器	Caspases 10	人的
细胞凋亡	效应器	Caspases 3	人与鼠
细胞凋亡	效应器	Caspases 6	人与鼠
细胞凋亡	效应器	Caspases 6	人与鼠
细胞焦亡	炎性的	Caspases 1	人与鼠
细胞焦亡	炎性的	Caspases 4	人的
细胞焦亡	炎性的	Caspases 5	人的

       启动器Caspase和效应器Caspase酶

      根据其在凋亡胱天蛋白酶途径中的作用，胱天蛋白酶可分为两类：启动器和效应器Caspase酶。启动器和效应器Caspas酶都具有由小亚基和大亚基组成的催化位点，Caspase酶的识别位

      凋亡启动器Caspase酶，例如caspase-2，-8，-9和-10可以启动caspase激活级联反应。Caspase-8对于形成死亡诱导信号复合物（DISC）是必不可少的，并且在激活后，Caspase-8激活下游效应子Caspase（例如Caspase 3）并介导线粒体中细胞色素c的释放。Caspase-8已被证明对IETD肽序列具有相对较高的底物选择性。凋亡效应胱天蛋白酶例如Caspase-3，-6和-7虽然不负责启动级联途径，但是当被激活时，它们在级联的中间和后续步骤中起着不可或缺的作用。Caspase-3（CPP32 / apopain）是关键效应器，因为它放大了来自启动器Caspase的信号，使用对Caspase-3有选择性的DEVD肽序列对活化的Caspase-3进行检测，可以检测Caspase-3的活性。

       Caspase酶底物和抑制剂

      Caspase底物和抑制剂由两个关键成分组成：Caspase识别序列和信号产生或蛋白酶抑制基序。不同Caspase识别序列不同，一般由三个或四个氨基酸组成（表2）。Caspase酶识别序列的N端通常有乙酰基（Ac）或碳苯甲氧基（Z）基团修饰，以增强膜的通透性。对应的Caspase识别特定的肽序列为其酶促反应切割位点，释放产生信号或抑制信号的基序。Caspase的显色和荧光底物均以相似的方式起作用，其中底物的信号或颜色强度与蛋白水解活性成正比。

       表2. Caspase的底物及其序列

多肽	氨基酸序列	对应的Caspase的种类
IETD	Ile-Glu-Thr-Asp	Caspase 8，颗粒酶B
DEVD	Asp-Glu-Val-Asp	Caspase 3、6、7、8或10
LEHD	Leu-Glu-His-Asp	Caspase 9
VAD	Val-Ala-Asp	Caspase 1、2、3、6、8、9或10

         Caspase酶的显色底物

      Caspase的显色底物是有Caspase识别序列及生色基团组成，常见的生色团有pNA（对硝基苯胺或4-硝基苯胺），可使用酶标仪或分光光度计在405 nm处进行光密度检测。

       表3. Caspase的显色底物

底物	Caspase	吸收（nm）	颜色
Ac-DEVD-pNA * CAS 189950-66-1 *	半胱天冬酶3	405 nm	黄色
Z-DEVD-pNA	半胱天冬酶3	405 nm	黄色
Z-IETD-pNA * CAS 219138-21-3 *	半胱天冬酶8，颗粒酶B	405 nm	黄色

       Caspase的荧光底物

      Caspase的荧光底物的结构包含与半胱天冬酶识别相关的荧光团，例如7-氨基-4-甲基香豆素（AMC），7-氨基-4-三氟甲基香豆素（AFC）， Rhodamine 110（R110）或ProRed™620。R110的Caspase底物比基于香豆素的Caspase底物（例如AMC和AFC）更敏感，但由于两步裂解过程，其动态范围更窄。 建议将R110标记的Caspase底物用于终点法测定，而将AMC和AFC标记的 Caspase底物用于动力学测定。

      图.从左到右，分别是AMC（7-氨基-4-甲基香豆素），AFC（7-氨基-4-三氟甲基香豆素），Rhodamine 110（R110）和ProRed™620的激发和发射光谱。

       表4.荧光半胱天冬酶底物。

底物名称	对应的Caspase	Ex（nm）	Em（nm）	ε¹	Φ²
Ac-DEVD-AFC * CAS 201608-14-2 *	半胱天冬酶3、7	376	482	17000	0.53
Ac-DEVD-AMC * CAS 169332-61-0 *	半胱天冬酶3、7	341	441	19000	N / D
Z-DEVD-AFC	半胱天冬酶3、7	376	482	17000	0.53
Z-DEVD-AMC * CAS 1135416-11-3 *	半胱天冬酶3、7	341	441	19000	N / D
Z-DEVD-ProRed™620	半胱天冬酶3、7	532	619	N / D	N / D
（Z-DEVD）2 -R110 * CAS 223538-61-2 *	半胱天冬酶3、7	500	522	80000	N / D
Z-DEVD-ProRed™620	半胱天冬酶3、7	532	619	N / D	N / D
Ac-IETD-AFC * CAS 211990-57-7 *	半胱天冬酶8，颗粒酶B	376	482	17000	0.53
Z-IETD-AFC * CAS 219138-02-0 *	半胱天冬酶8，颗粒酶B	376	482	17000	0.53

       注意：

        1.ε=在其最大吸收波长处的摩尔消光系数（单位= cm ^-1M ^-1）。

      2.Φ=水性缓冲液（pH 7.2）中的荧光量子产率。

       Caspase抑制剂

      Caspase抑制剂能与Caspase的活性位点结合并形成可逆或不可逆的连接，通常，Caspase抑制剂的结构由Caspase识别序列，诸如醛（-CHO）或氟甲基酮（-FMK）的官能团组成。具有醛官能团的胱天蛋白酶抑制剂是可逆的，而具有FMK的抑制剂是不可逆的。半胱天冬酶底物和抑制剂都具有较小的细胞毒性作用，因此，它们是研究半胱天冬酶活性的有用工具。

       表5. 可逆和不可逆的Caspase酶抑制剂

抑制剂	Caspase的种类	是否可逆	Ex（nm）	Em（nm）
Ac-DEVD-CHO * CAS 169332-60-9 *	半胱天冬酶3、7	可逆的	--	--
Ac-IETD-CHO * CAS 191338-86-0 *	半胱天冬酶8	可逆的	--	--
mFluor™450-VAD-FMK	半胱天冬酶1，2，3，6，8，9，10	不可逆的	406	445
mFluor™510-VAD-FMK	半胱天冬酶1，2，3，6，8，9，10	不可逆的	412	505
FITC-C6-DEVD-FMK	半胱天冬酶3、7	不可逆的	491	516
FITC-C6-DEVD-FMK	半胱天冬酶3、7	不可逆的	491	516
FITC-C6-LEHD-FMK	半胱天冬酶9	不可逆的	491	516
FITC-C6-LEHD-FMK	半胱天冬酶9	不可逆的	491	516
FAM-VAD-FMK	半胱天冬酶1，2，3，6，8，9，10	不可逆的	493	517
SRB-VAD-FMK [磺胺丁胺B-VAD-FMK]	半胱天冬酶1，2，3，6，8，9，10	不可逆的	559	577

多肽MCA-Tyr-Val-Ala-Asp-Ala-Pro-Lys(Dnp)-COOH的合成步骤：

1、合成CTC树脂：称取1.17g CTC Resin（如初始取代度约为1.17mmol/g）和1.64mmol Fmoc-Lys(Dnp)-OH于反应器中，加入适量DCM溶解氨基酸（需要注意，此时CTC树脂体积会增大好几倍，避免DCM溶液过少），再加入4.11mmol DIPEA（Mw：129.1,d：0.740g/ml），反应2-3小时后，可不抽滤溶液，直接加入1ml的HPLC级甲醇，封端半小时。依次用DMF洗涤2次，甲醇洗涤1次，DCM洗涤一次，甲醇洗涤一次，DCM洗涤一次，DMF洗涤2次（这里使用甲醇和DCM交替洗涤，是为了更好地去除其他溶质，有利于后续反应）。得到  Fmoc-Lys(Dnp)-CTC Resin。结构图如下：

2、脱Fmoc：加3倍树脂体积的20%Pip/DMF溶液，鼓氮气30分钟，然后2倍树脂体积的DMF 洗涤5次。得到 H2N-Lys(Dnp)-CTC Resin 。（此步骤脱除Fmoc基团，茚三酮检测为蓝色，Pip为哌啶）。结构图如下：

3、缩合：取4.11mmol Fmoc-Pro-OH 氨基酸，加入到上述树脂里，加适当DMF溶解氨基酸，再依次加入8.21mmol DIPEA，3.9mmol HBTU。反应30分钟后，取小样洗涤，茚三酮检测为无色。用2倍树脂体积的DMF 洗涤3次树脂。（洗涤树脂，去掉残留溶剂，为下一步反应做准备）。得到Fmoc-Pro-Lys(Dnp)-CTC Resin。氨基酸：DIPEA：HBTU：树脂=3：6：2.85：1（摩尔比）。结构图如下：

4、依次循环步骤二、步骤三，依次得到

H2N-Pro-Lys(Dnp)-CTC Resin

Fmoc-Ala-Pro-Lys(Dnp)-CTC Resin

H2N-Ala-Pro-Lys(Dnp)-CTC Resin

Fmoc-Asp(OtBu)-Ala-Pro-Lys(Dnp)-CTC Resin

H2N-Asp(OtBu)-Ala-Pro-Lys(Dnp)-CTC Resin

Fmoc-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Pro-Lys(Dnp)-CTC Resin

H2N-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Pro-Lys(Dnp)-CTC Resin

Fmoc-Val-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Pro-Lys(Dnp)-CTC Resin

H2N-Val-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Pro-Lys(Dnp)-CTC Resin

Fmoc-Tyr(tBu)-Val-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Pro-Lys(Dnp)-CTC Resin

以上中间结构，均可在专肽生物多肽计算器-多肽结构计算器中，一键画出。

最后再经过步骤二得到 H2N-Tyr(tBu)-Val-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Pro-Lys(Dnp)-CTC Resin，结构如下：

5、7-甲氧基香豆素-4-乙酸(MCA)反应连接：在上述树脂中，加入适当DMF后，再加入4.11mmol 7-甲氧基香豆素-4-乙酸(MCA)到树脂中，再加入8.21mmol DIPEA、3.9mmol HBTU，鼓氮气反应30分钟。用2倍树脂体积的DMF 洗涤3次树脂（洗涤树脂，去掉残留溶剂，为下一步反应做准备）。 得到MCA-Tyr(tBu)-Val-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Pro-Lys(Dnp)-CTCResin。 结构如下：

6、切割：6倍树脂体积的切割液（或每1g树脂加8ml左右的切割液），摇床摇晃 2小时，过滤掉树脂，用冰无水乙醚沉淀滤液，并用冰无水乙醚洗涤沉淀物3次，最后将沉淀物放真空干燥釜中，常温干燥24小试，得到粗品MCA-Tyr-Val-Ala-Asp-Ala-Pro-Lys(Dnp)-COOH。结构图见产品结构图。

切割液选择：1）TFA：H2O=95%：5%

2）TFA：H2O：TIS=95%：2.5%：2.5%

3）三氟乙酸：茴香硫醚：1，2-乙二硫醇：苯酚：水=87.5%：5%：2.5%：2.5%：2.5%

（前两种适合没有容易氧化的氨基酸，例如Trp、Cys、Met。第三种适合几乎所有的序列。）

6、纯化冻干：使用液相色谱纯化，收集目标峰液体，进行冻干，获得蓬松的粉末状固体多肽。不过这时要取小样复测下纯度 是否目标纯度。

7、最后总结：

杭州专肽生物技术有限公司（ALLPEPTIDE https://www.allpeptide.com）主营定制多肽合成业务，提供各类长肽，短肽，环肽，提供各类修饰肽，如：荧光标记修饰（CY3、CY5、CY5.5、CY7、FAM、FITC、Rhodamine B、TAMRA等），功能基团修饰肽（叠氮、炔基、DBCO、DOTA、NOTA等），同位素标记肽（N15、C13），订书肽（Stapled Peptide）,脂肪酸修饰肽（Pal、Myr、Ste），磷酸化修饰肽（P-Ser、P-Thr、P-Tyr），环肽（酰胺键环肽、一对或者多对二硫键环），生物素标记肽，PEG修饰肽，甲基化修饰肽

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